（一）凝膠層析法
凝膠層析又稱分子篩過(guò)濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。
⒈凝膠的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號(hào)的凝膠。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，由于它們?cè)诜峙湎禂?shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又叫分級(jí)分離。一般選用排阻限度略大于樣品中分子量物質(zhì)的凝膠，層析過(guò)程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于Kd不同，最后得到分離。
⒉柱的直徑與長(zhǎng)度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時(shí)，大多采用2-30cm長(zhǎng)的層析柱，分級(jí)分離時(shí)，一般需要100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。長(zhǎng)度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對(duì)移動(dòng)慢的物質(zhì)宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的制備凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個(gè)帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦?，然后在微微地?cái)嚢柘率鼓z下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時(shí)間，再開(kāi)始流動(dòng)平衡，流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速。在平衡過(guò)程中逐漸增加到層析的流速，千萬(wàn)不能超過(guò)最終流速。平衡凝膠床過(guò)夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無(wú)“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來(lái)觀察色帶的移動(dòng)，如帶狹窄、均勻平整說(shuō)明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過(guò)平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5％-10％。樣品濃度與分配系數(shù)無(wú)關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運(yùn)動(dòng)受限，故樣品與洗脫液的相對(duì)粘度不得超過(guò)1.5-2.樣品加入后打開(kāi)流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速，然后分部收集洗脫液，并對(duì)每一餾份做定性、定量測(cè)定。
⒌凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02％的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測(cè)定。
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
⒍凝膠層析的應(yīng)用
⑴脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡(jiǎn)便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過(guò)程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長(zhǎng)與直徑之比為5-15，樣品體積可達(dá)柱床體積的25％-30％，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。
⑵用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來(lái)去除無(wú)離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過(guò)濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。
（二）離子交換層析法
離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的一種方法。
⒈離子交換劑預(yù)處理和裝柱對(duì)于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對(duì)于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對(duì)于陽(yáng)離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達(dá)到充分平衡方可使用。
⒉加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時(shí)要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過(guò)濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過(guò)濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過(guò)柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來(lái)推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強(qiáng)度，其中最簡(jiǎn)單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時(shí)洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見(jiàn)圖16-6.兩個(gè)容器放于同一水平上，第一個(gè)容器盛有一定pH的緩沖液，第二個(gè)容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個(gè)容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時(shí)，第二容器中的溶液就會(huì)自動(dòng)來(lái)補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時(shí)間的濃度都可用下式進(jìn)行計(jì)算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對(duì)總體積之比。當(dāng)A1＝A2時(shí)為線性梯度，當(dāng)A1＞A2時(shí)為凹形梯度，A1＞A2時(shí)為凸形梯度。
洗脫時(shí)應(yīng)滿足以下要求：①洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來(lái)。③梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng)的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過(guò)早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過(guò)晚解吸會(huì)使峰形過(guò)寬。
⒊洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進(jìn)行測(cè)定，得到層析圖譜。依實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，可采用適宜的檢測(cè)方法（生物活性測(cè)定、免疫學(xué)測(cè)定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。
⒋離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑。對(duì)陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽(yáng)離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產(chǎn)品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學(xué)科領(lǐng)域。在生物化學(xué)及臨床生化檢驗(yàn)中主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。
凝膠層析又稱分子篩過(guò)濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。
⒈凝膠的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號(hào)的凝膠。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，由于它們?cè)诜峙湎禂?shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又叫分級(jí)分離。一般選用排阻限度略大于樣品中分子量物質(zhì)的凝膠，層析過(guò)程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于Kd不同，最后得到分離。
⒉柱的直徑與長(zhǎng)度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時(shí)，大多采用2-30cm長(zhǎng)的層析柱，分級(jí)分離時(shí)，一般需要100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。長(zhǎng)度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對(duì)移動(dòng)慢的物質(zhì)宜在30-40之間。
⒊凝膠柱的制備凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個(gè)帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦?，然后在微微地?cái)嚢柘率鼓z下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時(shí)間，再開(kāi)始流動(dòng)平衡，流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速。在平衡過(guò)程中逐漸增加到層析的流速，千萬(wàn)不能超過(guò)最終流速。平衡凝膠床過(guò)夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無(wú)“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來(lái)觀察色帶的移動(dòng)，如帶狹窄、均勻平整說(shuō)明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱。
⒋加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過(guò)平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5％-10％。樣品濃度與分配系數(shù)無(wú)關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運(yùn)動(dòng)受限，故樣品與洗脫液的相對(duì)粘度不得超過(guò)1.5-2.樣品加入后打開(kāi)流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速，然后分部收集洗脫液，并對(duì)每一餾份做定性、定量測(cè)定。
⒌凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02％的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測(cè)定。
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70％、90％、95％乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90％以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
⒍凝膠層析的應(yīng)用
⑴脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡(jiǎn)便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過(guò)程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱長(zhǎng)與直徑之比為5-15，樣品體積可達(dá)柱床體積的25％-30％，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。
⑵用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來(lái)去除無(wú)離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過(guò)濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。
（二）離子交換層析法
離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的一種方法。
⒈離子交換劑預(yù)處理和裝柱對(duì)于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對(duì)于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對(duì)于陽(yáng)離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達(dá)到充分平衡方可使用。
⒉加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時(shí)要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過(guò)濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過(guò)濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過(guò)柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來(lái)推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強(qiáng)度，其中最簡(jiǎn)單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時(shí)洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見(jiàn)圖16-6.兩個(gè)容器放于同一水平上，第一個(gè)容器盛有一定pH的緩沖液，第二個(gè)容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個(gè)容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時(shí)，第二容器中的溶液就會(huì)自動(dòng)來(lái)補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時(shí)間的濃度都可用下式進(jìn)行計(jì)算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對(duì)總體積之比。當(dāng)A1＝A2時(shí)為線性梯度，當(dāng)A1＞A2時(shí)為凹形梯度，A1＞A2時(shí)為凸形梯度。
洗脫時(shí)應(yīng)滿足以下要求：①洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來(lái)。③梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng)的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過(guò)早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過(guò)晚解吸會(huì)使峰形過(guò)寬。
⒊洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進(jìn)行測(cè)定，得到層析圖譜。依實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，可采用適宜的檢測(cè)方法（生物活性測(cè)定、免疫學(xué)測(cè)定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。
⒋離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑。對(duì)陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽(yáng)離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產(chǎn)品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學(xué)科領(lǐng)域。在生物化學(xué)及臨床生化檢驗(yàn)中主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。