【關(guān)鍵詞】 腦缺血；再灌注；絲裂原激活蛋白激酶類；細胞凋亡；梗塞，大腦中動脈；大鼠
Expression of extracellular signalregulated kinase in focal cerebral ischemia
ZHANG XiaoYan， YANG JinSheng， GU YouQuan， SHI XiangQun
Department of Neurology， Lanzhou General Hospital， Lanzhou Uilitary Area Command， Lanzhou 730050， China， Clinical Medical School， Lanzhou Mniversity， Lanzhou 730000， China
【Abstract】 AIM： To study the role of extracellular signalregulated kinase （ERK） during focal cerebral ischemiareperfusion in hippocampal neurons of rats. METHODS： Sixty male adult Wistar rats were randomly divided into 2 groups （n=30 per group）： the sham operation group and the ischemiareperfusion group（I/R group）。 The rats of I/R group were subjected to 2 h of right middle cerebral artery occlusion （MCAO） with introducing a nylon suture to the right internal carotid artery and then 3， 6， 24， 48 and 72 h of reperfusion， respectively（as 5 subgroups， n=6 in each subgroup）。 The histopathologic changes were observed by HE staining. The apoptotic neurons were detected in CA1 area of hippocampus by TUNEL method. ERK phosphorylation was detected by immunohistochemistry. RESULTS： In I/R group as compared with shamoperation group， after MCAO， the survival neurons in CA1 areas decreased； a lot of apoptotic cells were observed and peaked at 48 h； ERK activity increased 3 h after MCAO and peaked at 6 h and returned to the normal level at 72 h. CONCLUSION： Cerebral ischemiareperfusion may result in the upregulation of ERK activity， and participate in the process of neuron apoptosis.
【Keywords 】 brain ischemia； reperfusion； mitogen activated protein kinases； apoptosis； infarction， middle cerebral artery； rats
【摘要】 目的： 研究細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）在局灶性腦缺血再灌注海馬神經(jīng)元中的表達。 方法：線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。 大鼠隨機分成假手術(shù)組（sham組）、腦缺血再灌注組（I/R組），每組根據(jù)再灌注時間不同再分為3， 6， 24， 48和72 h亞組，每亞組各6只鼠。 在預(yù)定時間點進行HE染色觀察組織學(xué)變化；TUNEL法檢測CA1區(qū)細胞凋亡的動態(tài)變化規(guī)律；免疫組織化學(xué)方法研究ERK的表達特征。 結(jié)果：MCAO后海馬神經(jīng)元存活數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少；凋亡細胞大量出現(xiàn)，以48 h為高峰；MCAO后3 h，磷酸化ERK在局灶性腦缺血大鼠腦組織中顯著升高，6 h達到峰，72 h恢復(fù)到正常水平。 結(jié)論： 腦缺血再灌注損傷可能導(dǎo)致ERK活性上調(diào)，參與缺血后神經(jīng)細胞凋亡過程。
【關(guān)鍵詞】 腦缺血；再灌注；絲裂原激活蛋白激酶類；細胞凋亡；梗塞，大腦中動脈；大鼠
0引言
近年來人們對腦缺血再灌注損傷進行了廣泛研究，認為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細胞的損傷。 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activation protein kinases， MAPKs）通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子而改變基因的表達水平，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，參與細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡等生理、病理過程。 MAPKs的3個亞組： ERK， P38和cJun氨基末端激酶（cJunNH2terminal kinase， JNK）。 他們可被許多因子激活，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性而控制基因表達［1］。 研究發(fā)現(xiàn)ERK， p38和JNK在心、腦、肝、腎等組織細胞的缺血/再灌注過程中可被激活［2-3］。 我們選用大鼠大腦中動脈栓塞模型，測定在再灌注后不同時間點，缺血腦海馬CA1區(qū)ERK的活性特征及細胞凋亡的動態(tài)變化規(guī)律，試圖闡明ERK在大鼠腦缺血再灌注過程中所起的作用和機制。
1材料和方法
1.1材料凋亡檢測試劑盒、ERK試劑盒、DAB顯色劑均購于武漢博士德公司。 健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由蘭州大學(xué)試驗動物中心提供。
1.2方法
1.2.1實驗動物分組大鼠于術(shù)前在22～25℃環(huán)境中飼養(yǎng)1～2 d，術(shù)前夜禁食，隨意進水。 隨機分成假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組），根據(jù)再灌注時間不同每組再分為3， 6， 24， 48和72 h， 5個亞組，每亞組各6只鼠。
1.2.2模型制作根據(jù)Nagasawa等［4］的改良線栓法制成大鼠大腦中動脈缺血模型。 用水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，將其仰臥固定，分離右側(cè)頸總動脈（CCA），頸內(nèi)動脈（ICA）及頸外動脈（ECA），結(jié)扎ECA與CCA，用動脈夾夾閉ICA遠心端后，迅速于ECA 與ICA分叉下方剪一切口，將一預(yù)先用酒精燈燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動脈，插入深度為（18.5±0.5） mm，直到有輕微阻力感為止，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。 結(jié)扎入口處，尼龍線外留約1 cm，縫合皮膚。 2 h后輕輕提拉所留線頭至略有阻力，實現(xiàn)大腦中動脈再灌注，造模完成。 在缺血2 h和再灌注1 h內(nèi)，用白熾燈加熱維持大鼠的體溫，體溫維持在肛溫36.5～37.5℃。 假手術(shù)組只分離CCA與ECA.動物模型建立成功后按Longa等［5］法對動物的神經(jīng)功能進行評分，均在2～3分，即以動物清醒后，爬行時向左轉(zhuǎn)圈（追尾現(xiàn)象），提尾時左前肢內(nèi)收屈曲。 未達到上述標準者視為模型制作失敗，不計入實驗組。 因麻醉未清醒和經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)存在有蛛網(wǎng)膜下腔出血者均視為模型制作失敗，不計入實驗組。
1.2.3組織切片的制備大鼠再灌注后于3， 6， 24， 48和72 h各時間點，用水合氯醛深度麻醉動物后開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管剪開左心耳，用生理鹽水250 mL快速沖洗，隨后用多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（4℃， pH 7.4）先快后慢灌注約250 mL固定，斷頭取腦后， 在多聚甲醛中固定6～8 h，取視交叉后1～4 mm腦塊進行石蠟包埋，冠狀面切片，取齒狀回與海馬互包平面的切片，片厚3 μm.
1.2.4HE染色、組織學(xué)觀察3 μm切片貼片，空氣中干燥，入二甲苯脫脂，乙醇梯度脫水，蘇木素伊紅（HE）染色，二甲苯透明，中性樹脫封片，取24， 48， 72 h組大鼠切片在400倍光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內(nèi)存活神經(jīng)元數(shù)目。
1.2.5免疫組織化學(xué)采用免疫組化SABC法進行染色。 切片上滴加1∶200兔抗ERK抗體，4℃孵育過夜，接著用生物素連接的羊抗兔二抗在室溫下反應(yīng)90 min，再用卵白素生物素復(fù)合物室溫下反應(yīng)90 min，最后用DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染細胞核。 貼片，空氣中干燥，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，在顯微鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內(nèi)ERK染色陽性細胞數(shù)。
1.2.6原位細胞凋亡檢測取海馬冠狀石蠟切片，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水。 蛋白酶K（20 mg/L）室溫消化，用甲醇配制的過氧化氫消除內(nèi)源性辣根過氧化物酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）與地高辛標記的dUTP混合反應(yīng)液進行孵育，再加辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細胞，最后脫水透明封片。 在40×10倍Olympus顯微鏡下攝像觀察各組間細胞凋亡變化趨勢。 在400倍光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內(nèi)TUNEL染色陽性細胞數(shù)。
統(tǒng)計學(xué)處理： 所有數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，兩組資料不同的時間測量值比較采用重復(fù)測量的方差分析，檢驗水準取α＝0.05.
Expression of extracellular signalregulated kinase in focal cerebral ischemia
ZHANG XiaoYan， YANG JinSheng， GU YouQuan， SHI XiangQun
Department of Neurology， Lanzhou General Hospital， Lanzhou Uilitary Area Command， Lanzhou 730050， China， Clinical Medical School， Lanzhou Mniversity， Lanzhou 730000， China
【Abstract】 AIM： To study the role of extracellular signalregulated kinase （ERK） during focal cerebral ischemiareperfusion in hippocampal neurons of rats. METHODS： Sixty male adult Wistar rats were randomly divided into 2 groups （n=30 per group）： the sham operation group and the ischemiareperfusion group（I/R group）。 The rats of I/R group were subjected to 2 h of right middle cerebral artery occlusion （MCAO） with introducing a nylon suture to the right internal carotid artery and then 3， 6， 24， 48 and 72 h of reperfusion， respectively（as 5 subgroups， n=6 in each subgroup）。 The histopathologic changes were observed by HE staining. The apoptotic neurons were detected in CA1 area of hippocampus by TUNEL method. ERK phosphorylation was detected by immunohistochemistry. RESULTS： In I/R group as compared with shamoperation group， after MCAO， the survival neurons in CA1 areas decreased； a lot of apoptotic cells were observed and peaked at 48 h； ERK activity increased 3 h after MCAO and peaked at 6 h and returned to the normal level at 72 h. CONCLUSION： Cerebral ischemiareperfusion may result in the upregulation of ERK activity， and participate in the process of neuron apoptosis.
【Keywords 】 brain ischemia； reperfusion； mitogen activated protein kinases； apoptosis； infarction， middle cerebral artery； rats
【摘要】 目的： 研究細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）在局灶性腦缺血再灌注海馬神經(jīng)元中的表達。 方法：線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。 大鼠隨機分成假手術(shù)組（sham組）、腦缺血再灌注組（I/R組），每組根據(jù)再灌注時間不同再分為3， 6， 24， 48和72 h亞組，每亞組各6只鼠。 在預(yù)定時間點進行HE染色觀察組織學(xué)變化；TUNEL法檢測CA1區(qū)細胞凋亡的動態(tài)變化規(guī)律；免疫組織化學(xué)方法研究ERK的表達特征。 結(jié)果：MCAO后海馬神經(jīng)元存活數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少；凋亡細胞大量出現(xiàn)，以48 h為高峰；MCAO后3 h，磷酸化ERK在局灶性腦缺血大鼠腦組織中顯著升高，6 h達到峰，72 h恢復(fù)到正常水平。 結(jié)論： 腦缺血再灌注損傷可能導(dǎo)致ERK活性上調(diào)，參與缺血后神經(jīng)細胞凋亡過程。
【關(guān)鍵詞】 腦缺血；再灌注；絲裂原激活蛋白激酶類；細胞凋亡；梗塞，大腦中動脈；大鼠
0引言
近年來人們對腦缺血再灌注損傷進行了廣泛研究，認為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細胞的損傷。 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activation protein kinases， MAPKs）通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子而改變基因的表達水平，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，參與細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡等生理、病理過程。 MAPKs的3個亞組： ERK， P38和cJun氨基末端激酶（cJunNH2terminal kinase， JNK）。 他們可被許多因子激活，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性而控制基因表達［1］。 研究發(fā)現(xiàn)ERK， p38和JNK在心、腦、肝、腎等組織細胞的缺血/再灌注過程中可被激活［2-3］。 我們選用大鼠大腦中動脈栓塞模型，測定在再灌注后不同時間點，缺血腦海馬CA1區(qū)ERK的活性特征及細胞凋亡的動態(tài)變化規(guī)律，試圖闡明ERK在大鼠腦缺血再灌注過程中所起的作用和機制。
1材料和方法
1.1材料凋亡檢測試劑盒、ERK試劑盒、DAB顯色劑均購于武漢博士德公司。 健康雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由蘭州大學(xué)試驗動物中心提供。
1.2方法
1.2.1實驗動物分組大鼠于術(shù)前在22～25℃環(huán)境中飼養(yǎng)1～2 d，術(shù)前夜禁食，隨意進水。 隨機分成假手術(shù)組（sham組）、缺血再灌注組（I/R組），根據(jù)再灌注時間不同每組再分為3， 6， 24， 48和72 h， 5個亞組，每亞組各6只鼠。
1.2.2模型制作根據(jù)Nagasawa等［4］的改良線栓法制成大鼠大腦中動脈缺血模型。 用水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，將其仰臥固定，分離右側(cè)頸總動脈（CCA），頸內(nèi)動脈（ICA）及頸外動脈（ECA），結(jié)扎ECA與CCA，用動脈夾夾閉ICA遠心端后，迅速于ECA 與ICA分叉下方剪一切口，將一預(yù)先用酒精燈燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動脈，插入深度為（18.5±0.5） mm，直到有輕微阻力感為止，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。 結(jié)扎入口處，尼龍線外留約1 cm，縫合皮膚。 2 h后輕輕提拉所留線頭至略有阻力，實現(xiàn)大腦中動脈再灌注，造模完成。 在缺血2 h和再灌注1 h內(nèi)，用白熾燈加熱維持大鼠的體溫，體溫維持在肛溫36.5～37.5℃。 假手術(shù)組只分離CCA與ECA.動物模型建立成功后按Longa等［5］法對動物的神經(jīng)功能進行評分，均在2～3分，即以動物清醒后，爬行時向左轉(zhuǎn)圈（追尾現(xiàn)象），提尾時左前肢內(nèi)收屈曲。 未達到上述標準者視為模型制作失敗，不計入實驗組。 因麻醉未清醒和經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)存在有蛛網(wǎng)膜下腔出血者均視為模型制作失敗，不計入實驗組。
1.2.3組織切片的制備大鼠再灌注后于3， 6， 24， 48和72 h各時間點，用水合氯醛深度麻醉動物后開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管剪開左心耳，用生理鹽水250 mL快速沖洗，隨后用多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（4℃， pH 7.4）先快后慢灌注約250 mL固定，斷頭取腦后， 在多聚甲醛中固定6～8 h，取視交叉后1～4 mm腦塊進行石蠟包埋，冠狀面切片，取齒狀回與海馬互包平面的切片，片厚3 μm.
1.2.4HE染色、組織學(xué)觀察3 μm切片貼片，空氣中干燥，入二甲苯脫脂，乙醇梯度脫水，蘇木素伊紅（HE）染色，二甲苯透明，中性樹脫封片，取24， 48， 72 h組大鼠切片在400倍光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內(nèi)存活神經(jīng)元數(shù)目。
1.2.5免疫組織化學(xué)采用免疫組化SABC法進行染色。 切片上滴加1∶200兔抗ERK抗體，4℃孵育過夜，接著用生物素連接的羊抗兔二抗在室溫下反應(yīng)90 min，再用卵白素生物素復(fù)合物室溫下反應(yīng)90 min，最后用DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染細胞核。 貼片，空氣中干燥，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，在顯微鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內(nèi)ERK染色陽性細胞數(shù)。
1.2.6原位細胞凋亡檢測取海馬冠狀石蠟切片，常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水。 蛋白酶K（20 mg/L）室溫消化，用甲醇配制的過氧化氫消除內(nèi)源性辣根過氧化物酶活性，加末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）與地高辛標記的dUTP混合反應(yīng)液進行孵育，再加辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體孵育，用DAB顯色，核呈深棕黃色者為凋亡細胞，最后脫水透明封片。 在40×10倍Olympus顯微鏡下攝像觀察各組間細胞凋亡變化趨勢。 在400倍光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中段100單位長度內(nèi)TUNEL染色陽性細胞數(shù)。
統(tǒng)計學(xué)處理： 所有數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，兩組資料不同的時間測量值比較采用重復(fù)測量的方差分析，檢驗水準取α＝0.05.