摘要：本文使用質粒DNA評價法（plasmid DNA assay）和電感偶合等離子體質譜（ICP-MS）研究了北京市室內外PM10的生物活性及其與微量元素的關系。本研究選擇了6組樣品分別代表室內和相應室外進行質粒DNA評價研究。結果表明，廚房內采集的PM10的TD50 (50%的DNA被破壞時的PM10的劑量) 低，為45µg mL-1，對DNA的損傷大，表明具有高的生物活性。而兩個抽煙室內采集到的PM10的TD50分別為100和263µg mL-1，具有較強的生物活性。結合ICP-MS得到的微量元素結果分析發(fā)現(xiàn)， PM10的水溶性Zn與TD50較其它元素相比具有更好的負相關性，說明水溶Zn可能造成DNA的氧化性損傷的主要原因。
關鍵詞：質粒DNA評價 生物活性 微量元素 室內空氣 可吸入顆粒物（PM10）
近年來，PM10對人體的損傷效應引起了廣泛的關注，流行病學研究結果表明PM10濃度的增加與人們發(fā)病率及死亡率之間有顯著的相關性。關于顆粒物的肺損傷目前被廣泛接受的觀點是顆粒物表面的生物可利用的重金屬離子會產(chǎn)生自由基，這些自由基對關鍵細胞的氧化性損傷可能是顆粒物導致肺損傷的主要原因。Wilson等通過有過渡金屬和沒有過渡金屬兩種情況下的炭黑和超細炭粒子的自由基及致炎作用的研究，證明PM10中的過渡金屬對肺具有氧化性損傷。
McNeilly等利用體外實驗的方法證明水溶性重金屬會導致炎癥。Richards等[10]研究表明導致肺損傷的是可溶的而非不可溶的鋅；Adamson等利用活體實驗研究發(fā)現(xiàn)，造成老鼠肺損傷的是水溶Zn。王玉秋等研究發(fā)現(xiàn)Fe是典型介導氧自由基過程的重金屬。中國礦業(yè)大學（北京）環(huán)境與健康課題組的研究表明對DNA產(chǎn)生氧化性損傷的是顆粒物中的水溶性組分，其中水溶性的Zn元素可能是對DNA氧化性損傷的主要重金屬元素，并提出吸煙室內可吸入顆粒物比不吸煙室內可吸入顆粒物具有更強毒性。本文利用質粒DNA評價法對居室室內PM10樣品的生物活性進行研究，并利用ICP-MS對PM10的微量元素進行研究，后判別不同類型室內PM10的氧化性損傷能力強弱以及可能導致這種損傷能力的重元素類型。
1.樣品采集及室內實驗
1.1樣品采樣
2003年7月在北京市2戶（吸煙，非吸煙家庭）客廳、廚房(烹飪時)各采樣3天，每天連續(xù)采樣8小時以上。采樣點位于中國礦業(yè)大學附近，由于條件限制，所以只在白天居民正常的生活條件下進行采樣。同時在室外采集PM10樣品，避免雨天。采樣儀空氣流速為30 L/min，采樣頭距地面高度為1.5m左右。隨時記錄室內外溫度、濕度及風速。本次實驗的采樣頭為Negretti（UK）PM10切割器，所用濾膜為直徑47mm，孔徑0.6µm聚碳酸酯濾膜（Millipore, UK）。
1.2 DNA損傷實驗及電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）實驗
質粒DNA評價法是一種研究顆粒物表面的自由基對超螺旋DNA產(chǎn)生氧化性損傷的體外方法。基本原理是顆粒物表面攜帶的自由基對超螺旋DNA產(chǎn)生氧化性損傷，初的損傷是引起超螺旋DNA松弛；進一步的損傷表現(xiàn)為使DNA線化。這種損傷變化引起DNA在電泳儀中的電泳淌度的變化，進而將不同形態(tài)的DNA在瓊脂糖凝膠中分離開，并在專門軟件中進行定量分析，以此來評價顆粒物的生物活性（圖1）。具體實驗步驟參見文獻，首先將顆粒物從濾膜上分離出來后，使用超純水將樣品稀釋成4-5個不同的濃度級別，分別與一定量的質粒DNA(φX174-RF DNA, Promega, London, UK)進行混合并使其充分反應，然后將混合溶液置入電泳槽凝膠中，使用電泳儀在30V電壓下通電16小時，將不同形態(tài)的DNA分離開來，后使用紫外凝膠成像系統(tǒng)（Synoptics LTM, Cambridge, UK）對凝膠成像，并使用Syngene Genetools軟件（Synoptics Ltd.）和光密度計對凝膠體中的超螺旋、松弛的及線化的等不同形態(tài)的DNA進行半定量分析，其中松弛和線化的DNA占總DNA的比例即代表樣品的氧化性損傷能力或生物活性，其中一個重要的參數(shù)TD50，它代表造成50%的DNA損傷所需的樣品的劑量（toxic dose），TD50值越小，顆粒物生物活性越大。
使用ICP-MS進行顆粒物中微量重金屬元素進行分析。對水溶部分微量元素的測量，是將濾膜放入10mL HPLC級水中，使用渦旋混合器震蕩6小時；然后使用0.2m孔徑的聚碳酸酯濾膜（Millipore）過濾，即為水溶部分樣品；從制備好的溶液中取出1mL，與0.5mL的50ppb銠標準液混合，并加入2%硝酸至5mL；使用ICP-MS（Perkin Elmer Elan 5000）進行化學成分分析。
2．結果與討論
2.1 室內/外PM10的DNA氧化性損傷研究
本次選擇六個樣品中，No.1為廚房中采集到的PM10，其質量濃度為205.9µg m-3；No.2和No.3為兩個吸煙室內PM10，其質量濃度分別為51.1µg m-3和611.1µg m-3；No.4和No.5為非吸煙室內的PM10，質量濃度分別為29.3和91.2µg m-3；No.6為相應的室外PM10，其質量濃度為38.8µg m-3。六組樣品對超螺旋DNA損傷的定量分析結果如圖2所示，其TD50值見圖3。從圖3可以看出，廚房中采集到的PM10樣品 (No.1) 對DNA的氧化性損傷大，其TD50低達45µg mL-1，當其劑量為75µg mL-1時，就有97.8%的DNA被破壞，而且當劑量再增加時，DNA的破壞量略有增加 (圖2)。吸煙的室內PM10對DNA的損傷較非吸煙室內和室外PM10的損傷大，TD50為100和263µg mL-1；非吸煙室內No.4樣品在250µg mL-1的濃度下造成的損傷為60%，而在125µg mL-1時，損傷為17%，所以其TD50在125~250µg mL-1之間，而No.5樣品即使在濃度為500µg mL-1對DNA的損傷才達38%，說明其生物活性較?。皇彝釴o.6樣品在250µg mL-1 時對DNA的損傷達30%，TD50為415µg mL-1。很明顯，廚房中采集到的PM10樣品的TD50值小，表明其生物活性大，吸煙室內的樣品次之，具較強的生物活性。筆者曾針對前四個樣品的實驗結果證明吸煙家庭的可吸入顆粒物比不吸煙家庭的可吸入顆粒物有更高的生物活性，本次將新做的廚房可吸入顆粒物的實驗結果加入數(shù)據(jù)組，結果顯示廚房采集的可吸入顆粒物生物活性及毒性相對高。
2.2導致PM10的氧化性損傷的原因淺析
為說明引起質粒DNA損傷的主要原因，我們將4組樣品的TD50值與這些樣品的水溶性組分中的主要重金屬元素As、Cu、Ni、Pb、Zn等的含量進行相關分析（為了便于比較，No.4的TD50介于125~250µg mL-1，值取200µg mL-1；No.5的TD50取600µg mL-1）。
雖然As、Cu、Ni、Pb在水溶組分中含量較高，但是它們與樣品的TD50值并沒有對應相關關系，說明這些元素可能不是造成質粒DNA損傷的主要元素。比較有意思的是Zn元素，從圖4可看出水溶組分中Zn元素的含量與TD50值呈明顯的負相關關系，即Zn含量越高，樣品造成的DNA損傷越大。水溶性的Zn在No.2 (吸煙室內) 樣品的含量高，其TD50值也小，這表明水溶性的Zn可能是PM10造成DNA損傷的重要重金屬元素。
(a)廚房內(No.1); (b)吸煙室內(No.2); (c)吸煙室內(No.3); (d)非吸煙室內(No.4);(e) 非吸煙室內(No.5); (f)室外(No.6)
關于水溶性Zn的氧化性損傷能力，Richards等和Adamson 等都從對老鼠肺損傷的活體實驗中證實。關于香煙煙霧對肺及DNA的氧化性損傷作用，已有許多學者論述。結合本文實驗，可以認為水溶性的Zn可能是導致PM10具有氧化性損傷的主要因素之一。
除Zn之外，F(xiàn)e亦是一種具有較強氧化性損傷能力的重金屬元素，但是在本次分析樣品中，F(xiàn)e與顆粒物的氧化性損傷能力的關系不甚明顯。4個樣品的水溶性的Fe的含量幾乎都為0，說明在本次實驗PM10中的鐵是以非水溶狀態(tài)存在，因此不是造成DNA氧化性損傷的主要元素。
近來的研究表明烹調油煙霧的各組分，包括油煙冷凝物、殘留油、油煙顆粒物、油揮發(fā)性有機物均能誘導DNA氧化產(chǎn)生8-OhdG，造成氧化損傷。值得指出的是，吸煙造成的可吸入顆粒物的氧化性損傷力，除與重金屬元素Zn有關外，還與煙草中的焦油含量關系密切，Landsberger等[21]應用中子活化分析室內吸煙產(chǎn)生的微量元素Cd、Zn是室內吸煙來源的主要污染物，吸煙的煙草煙霧（ETS）中含有4700多種化學物質，有較高濃度的焦油、苯、多環(huán)芳烴（PAHs）等，其中焦油中含有的許多微量元素，對人體產(chǎn)生極大危害。吸煙室內可吸入顆粒物中的焦油含量及有機質與顆粒物氧化性損傷能力的關系還有待今后進一步探討。
關鍵詞：質粒DNA評價 生物活性 微量元素 室內空氣 可吸入顆粒物（PM10）
近年來，PM10對人體的損傷效應引起了廣泛的關注，流行病學研究結果表明PM10濃度的增加與人們發(fā)病率及死亡率之間有顯著的相關性。關于顆粒物的肺損傷目前被廣泛接受的觀點是顆粒物表面的生物可利用的重金屬離子會產(chǎn)生自由基，這些自由基對關鍵細胞的氧化性損傷可能是顆粒物導致肺損傷的主要原因。Wilson等通過有過渡金屬和沒有過渡金屬兩種情況下的炭黑和超細炭粒子的自由基及致炎作用的研究，證明PM10中的過渡金屬對肺具有氧化性損傷。
McNeilly等利用體外實驗的方法證明水溶性重金屬會導致炎癥。Richards等[10]研究表明導致肺損傷的是可溶的而非不可溶的鋅；Adamson等利用活體實驗研究發(fā)現(xiàn)，造成老鼠肺損傷的是水溶Zn。王玉秋等研究發(fā)現(xiàn)Fe是典型介導氧自由基過程的重金屬。中國礦業(yè)大學（北京）環(huán)境與健康課題組的研究表明對DNA產(chǎn)生氧化性損傷的是顆粒物中的水溶性組分，其中水溶性的Zn元素可能是對DNA氧化性損傷的主要重金屬元素，并提出吸煙室內可吸入顆粒物比不吸煙室內可吸入顆粒物具有更強毒性。本文利用質粒DNA評價法對居室室內PM10樣品的生物活性進行研究，并利用ICP-MS對PM10的微量元素進行研究，后判別不同類型室內PM10的氧化性損傷能力強弱以及可能導致這種損傷能力的重元素類型。
1.樣品采集及室內實驗
1.1樣品采樣
2003年7月在北京市2戶（吸煙，非吸煙家庭）客廳、廚房(烹飪時)各采樣3天，每天連續(xù)采樣8小時以上。采樣點位于中國礦業(yè)大學附近，由于條件限制，所以只在白天居民正常的生活條件下進行采樣。同時在室外采集PM10樣品，避免雨天。采樣儀空氣流速為30 L/min，采樣頭距地面高度為1.5m左右。隨時記錄室內外溫度、濕度及風速。本次實驗的采樣頭為Negretti（UK）PM10切割器，所用濾膜為直徑47mm，孔徑0.6µm聚碳酸酯濾膜（Millipore, UK）。
1.2 DNA損傷實驗及電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）實驗
質粒DNA評價法是一種研究顆粒物表面的自由基對超螺旋DNA產(chǎn)生氧化性損傷的體外方法。基本原理是顆粒物表面攜帶的自由基對超螺旋DNA產(chǎn)生氧化性損傷，初的損傷是引起超螺旋DNA松弛；進一步的損傷表現(xiàn)為使DNA線化。這種損傷變化引起DNA在電泳儀中的電泳淌度的變化，進而將不同形態(tài)的DNA在瓊脂糖凝膠中分離開，并在專門軟件中進行定量分析，以此來評價顆粒物的生物活性（圖1）。具體實驗步驟參見文獻，首先將顆粒物從濾膜上分離出來后，使用超純水將樣品稀釋成4-5個不同的濃度級別，分別與一定量的質粒DNA(φX174-RF DNA, Promega, London, UK)進行混合并使其充分反應，然后將混合溶液置入電泳槽凝膠中，使用電泳儀在30V電壓下通電16小時，將不同形態(tài)的DNA分離開來，后使用紫外凝膠成像系統(tǒng)（Synoptics LTM, Cambridge, UK）對凝膠成像，并使用Syngene Genetools軟件（Synoptics Ltd.）和光密度計對凝膠體中的超螺旋、松弛的及線化的等不同形態(tài)的DNA進行半定量分析，其中松弛和線化的DNA占總DNA的比例即代表樣品的氧化性損傷能力或生物活性，其中一個重要的參數(shù)TD50，它代表造成50%的DNA損傷所需的樣品的劑量（toxic dose），TD50值越小，顆粒物生物活性越大。
使用ICP-MS進行顆粒物中微量重金屬元素進行分析。對水溶部分微量元素的測量，是將濾膜放入10mL HPLC級水中，使用渦旋混合器震蕩6小時；然后使用0.2m孔徑的聚碳酸酯濾膜（Millipore）過濾，即為水溶部分樣品；從制備好的溶液中取出1mL，與0.5mL的50ppb銠標準液混合，并加入2%硝酸至5mL；使用ICP-MS（Perkin Elmer Elan 5000）進行化學成分分析。
2．結果與討論
2.1 室內/外PM10的DNA氧化性損傷研究
本次選擇六個樣品中，No.1為廚房中采集到的PM10，其質量濃度為205.9µg m-3；No.2和No.3為兩個吸煙室內PM10，其質量濃度分別為51.1µg m-3和611.1µg m-3；No.4和No.5為非吸煙室內的PM10，質量濃度分別為29.3和91.2µg m-3；No.6為相應的室外PM10，其質量濃度為38.8µg m-3。六組樣品對超螺旋DNA損傷的定量分析結果如圖2所示，其TD50值見圖3。從圖3可以看出，廚房中采集到的PM10樣品 (No.1) 對DNA的氧化性損傷大，其TD50低達45µg mL-1，當其劑量為75µg mL-1時，就有97.8%的DNA被破壞，而且當劑量再增加時，DNA的破壞量略有增加 (圖2)。吸煙的室內PM10對DNA的損傷較非吸煙室內和室外PM10的損傷大，TD50為100和263µg mL-1；非吸煙室內No.4樣品在250µg mL-1的濃度下造成的損傷為60%，而在125µg mL-1時，損傷為17%，所以其TD50在125~250µg mL-1之間，而No.5樣品即使在濃度為500µg mL-1對DNA的損傷才達38%，說明其生物活性較?。皇彝釴o.6樣品在250µg mL-1 時對DNA的損傷達30%，TD50為415µg mL-1。很明顯，廚房中采集到的PM10樣品的TD50值小，表明其生物活性大，吸煙室內的樣品次之，具較強的生物活性。筆者曾針對前四個樣品的實驗結果證明吸煙家庭的可吸入顆粒物比不吸煙家庭的可吸入顆粒物有更高的生物活性，本次將新做的廚房可吸入顆粒物的實驗結果加入數(shù)據(jù)組，結果顯示廚房采集的可吸入顆粒物生物活性及毒性相對高。
2.2導致PM10的氧化性損傷的原因淺析
為說明引起質粒DNA損傷的主要原因，我們將4組樣品的TD50值與這些樣品的水溶性組分中的主要重金屬元素As、Cu、Ni、Pb、Zn等的含量進行相關分析（為了便于比較，No.4的TD50介于125~250µg mL-1，值取200µg mL-1；No.5的TD50取600µg mL-1）。
雖然As、Cu、Ni、Pb在水溶組分中含量較高，但是它們與樣品的TD50值并沒有對應相關關系，說明這些元素可能不是造成質粒DNA損傷的主要元素。比較有意思的是Zn元素，從圖4可看出水溶組分中Zn元素的含量與TD50值呈明顯的負相關關系，即Zn含量越高，樣品造成的DNA損傷越大。水溶性的Zn在No.2 (吸煙室內) 樣品的含量高，其TD50值也小，這表明水溶性的Zn可能是PM10造成DNA損傷的重要重金屬元素。
(a)廚房內(No.1); (b)吸煙室內(No.2); (c)吸煙室內(No.3); (d)非吸煙室內(No.4);(e) 非吸煙室內(No.5); (f)室外(No.6)
關于水溶性Zn的氧化性損傷能力，Richards等和Adamson 等都從對老鼠肺損傷的活體實驗中證實。關于香煙煙霧對肺及DNA的氧化性損傷作用，已有許多學者論述。結合本文實驗，可以認為水溶性的Zn可能是導致PM10具有氧化性損傷的主要因素之一。
除Zn之外，F(xiàn)e亦是一種具有較強氧化性損傷能力的重金屬元素，但是在本次分析樣品中，F(xiàn)e與顆粒物的氧化性損傷能力的關系不甚明顯。4個樣品的水溶性的Fe的含量幾乎都為0，說明在本次實驗PM10中的鐵是以非水溶狀態(tài)存在，因此不是造成DNA氧化性損傷的主要元素。
近來的研究表明烹調油煙霧的各組分，包括油煙冷凝物、殘留油、油煙顆粒物、油揮發(fā)性有機物均能誘導DNA氧化產(chǎn)生8-OhdG，造成氧化損傷。值得指出的是，吸煙造成的可吸入顆粒物的氧化性損傷力，除與重金屬元素Zn有關外，還與煙草中的焦油含量關系密切，Landsberger等[21]應用中子活化分析室內吸煙產(chǎn)生的微量元素Cd、Zn是室內吸煙來源的主要污染物，吸煙的煙草煙霧（ETS）中含有4700多種化學物質，有較高濃度的焦油、苯、多環(huán)芳烴（PAHs）等，其中焦油中含有的許多微量元素，對人體產(chǎn)生極大危害。吸煙室內可吸入顆粒物中的焦油含量及有機質與顆粒物氧化性損傷能力的關系還有待今后進一步探討。