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胞嘧啶脫氨酶基因?qū)肽[瘤細(xì)胞可將無毒性的原藥在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝為具細(xì)胞毒的產(chǎn)物而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本文綜述了該基因的克隆、作用機(jī)制和在消化道腫瘤治療中的研究進(jìn)展。
隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，基因治療這一嶄新方法盡管還多處于實(shí)驗(yàn)研究手段，卻已顯示出良好的應(yīng)用前景。自1991年Huber等提出病毒導(dǎo)向的酶解原藥療法以來，有關(guān)的基因研究成為熱門課題。目前，一個(gè)新的基因治療系統(tǒng)——EC-CD/5-FC系統(tǒng)正日益受到高度關(guān)注。本文就胞嘧啶脫氨酶基因治療消化道腫瘤的現(xiàn)狀作一綜述。
CD基因的克隆
胞嘧啶脫氨酶是大腸桿菌代謝旁路中的一種酶，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不含該酶。Austin等于1992年首先從大腸桿菌株中采用傳統(tǒng)方法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)一步分離、純化并轉(zhuǎn)染宿主菌，初步構(gòu)建成原核細(xì)胞中表達(dá)的CD質(zhì)粒載體，克隆了編碼CD的大腸桿菌基因，利用陽性基因篩選方法，獲得一攜帶10.8kb的DNA插入質(zhì)粒，其中一3kb的DNA片段保留有CD酶活性。CK蛋白質(zhì)分子量為52000，DNA序列分析顯示一含427個(gè)氨基酸開放讀碼框架編碼CD。
為證實(shí)CD基因在真核細(xì)胞中表達(dá)以發(fā)揮作用，研究者采用寡核苷酸突變技術(shù)，將CD基因起始密碼子由GTG→ATG，從而產(chǎn)生一5’起始密碼子，選擇pRc/CMV真核表達(dá)載體，構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV/CD-1。以脂質(zhì)體法將pCMV/CD-1導(dǎo)入人結(jié)腸癌WiDr細(xì)胞系，生長抑制試驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FC的IC50為30μmol，而未轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞其IC50為17000μmol，表明轉(zhuǎn)染有CD基因的結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FC的敏感性提高了近560倍。
CD基因轉(zhuǎn)移方法
安全有效的基因轉(zhuǎn)移方法是基因治療的關(guān)鍵因素之一。至今，作為基因轉(zhuǎn)移的載體，以病毒性載體介導(dǎo)的方法研究為系統(tǒng)深入，幾乎應(yīng)用于所有的靶系統(tǒng)。在消化道腫瘤的CD基因治療中，既往的研究仍選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這與對其基因組結(jié)構(gòu)和生活周期了解得較清楚有關(guān)。RV載體大多由Moloney小鼠白血病病毒構(gòu)建而成，為RNA病毒，基因組編碼在一條單鏈RNA分子上，進(jìn)入細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，此DNA進(jìn)入細(xì)胞核整合在受體細(xì)胞DNA上，并以此為模板合成病毒基因和后代RNA。采用RV轉(zhuǎn)導(dǎo)CD基因，將CD基因整合于病毒長末端重復(fù)的末端，因而整合后的病毒基因結(jié)構(gòu)可受到保護(hù)不致受損。
目前轉(zhuǎn)導(dǎo)CD基因多選擇腺病毒載體。由于腺病毒為一雙鏈DNA病毒，宿主范圍廣泛，尤其能有效地感染非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，另外，它不能整合到宿主細(xì)胞染色體上，因而較逆轉(zhuǎn)錄病毒更為安全。重組腺病毒載體主要來自于2型和5型腺病毒，容量大，可裝載達(dá)7.6kb。已有學(xué)者選用Ad載體介導(dǎo)CD基因轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌HT29細(xì)胞系，將攜帶有大腸桿菌標(biāo)記基因的腺病毒注射到腫瘤組織中底物X-gal染色來判斷基因轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示外源基因經(jīng)單次注入后近5%-30%的腫瘤組織表達(dá)Lacz基因。
作用機(jī)制
由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在CD，因而不能將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，更不能將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成5-氟尿嘧啶。但通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將CD基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，則哺乳動(dòng)物細(xì)胞可將一些原來無毒性的原藥轉(zhuǎn)化為有細(xì)胞毒性的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞自殺性死亡。5-FC在高度抗微生物活性的濃度下對哺乳動(dòng)物無毒性作用，經(jīng)CD脫氨為5-FU，后者則具有高度細(xì)胞毒性，為臨床廣泛使用的抗腫瘤化療藥物。
CD基因作用的一個(gè)十分突出特點(diǎn)即所謂的“旁觀者效應(yīng)”，這與某些自殺基因的作用機(jī)制相似。Hirschowitz等早觀察到CD基因治療結(jié)腸癌時(shí)的這一效應(yīng)，當(dāng)CD+的結(jié)腸癌細(xì)胞與CD-的結(jié)腸癌細(xì)胞混合時(shí)，比較了CD+的細(xì)胞比例為10%和100%時(shí)兩者的細(xì)胞生長抑制水平，結(jié)果無顯著性差異。對旁觀者效應(yīng)尚缺乏確切的解釋，但大多同意“縫隙連接”引起旁觀者效應(yīng)，通過細(xì)胞間的接觸，毒性代謝產(chǎn)物由“縫隙連接”從CD+的細(xì)胞轉(zhuǎn)入CD-的細(xì)胞，從而使得后者變得原藥也敏感了，并被原藥代謝產(chǎn)物殺死。但亦有學(xué)者提出不同意見，Trinh等通過電鏡發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織鄰近區(qū)域有大量的“橋?！贝嬖?，因其起著封閉細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，推測旁觀者效應(yīng)并非上述機(jī)制，尚有其它機(jī)制參與，如細(xì)胞凋亡、原藥代謝產(chǎn)物本身可穿過細(xì)胞膜等可能機(jī)制。
幾種消化道腫瘤CD基因治療現(xiàn)狀
結(jié)腸癌CD基因治療的研究對象以結(jié)腸癌為多。Huber等觀察到*鼠5-FC的半衰腸期大約是40分鐘，腹腔內(nèi)給予500mg/的5-FC，其血漿水平可維持在4000μmol。體外試驗(yàn)顯示：對于CD+結(jié)腸癌細(xì)胞，5-FC的IC50僅為5μmol；而體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明無論是腹腔內(nèi)還是靜脈內(nèi)給予5-FC，都同樣觀察到明顯的抗腫瘤效應(yīng)。
Richard等將組織特異性因子癌胚抗原轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的三個(gè)部分分別插入到含CD基因的pCMV/CD-1中，構(gòu)建了一系列pCEA/CD基因載體，通過分析熒光素活性，篩選出活性高的pCEA/CD-145基因。體外實(shí)驗(yàn)將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸癌NCIH508細(xì)胞中，在5-FC存在下，基因表達(dá)發(fā)揮出良好的原藥轉(zhuǎn)換抗腫瘤效應(yīng)，CD+的NCIH508細(xì)胞其IC50＜2μmol，而CD－的NCIH508細(xì)胞其IC50達(dá)516μmol。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)比較轉(zhuǎn)導(dǎo)前后的大腸癌細(xì)胞*鼠體內(nèi)成瘤后，給予5-FU500μg(kgd，），連續(xù)20日，細(xì)果顯示未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD的大腸癌細(xì)胞成瘤*鼠腫瘤重量增加了近3倍，而轉(zhuǎn)導(dǎo)CD的大腸癌細(xì)胞成瘤*鼠腫瘤重量基本未改變。
肝腫瘤肝原發(fā)或繼發(fā)腫瘤的基因治療研究報(bào)道多。由于肝臟是結(jié)腸癌常轉(zhuǎn)移的部位，因此，Ohwada等在建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，給予人結(jié)腸癌荷瘤*鼠肝內(nèi)注射AdCMV.CD和腹腔內(nèi)每周二次給予5-FC，以點(diǎn)雜交分析肝內(nèi)人結(jié)腸癌細(xì)胞DNA數(shù)量來判斷抑制轉(zhuǎn)移瘤效果。結(jié)果與對照組相比，治療組肝內(nèi)人結(jié)腸癌細(xì)胞DNA數(shù)量顯著低于各對照組，級組織學(xué)檢查顯示治療組注射部位肝腫瘤出現(xiàn)壞死，對照組未見此現(xiàn)象，且治療組中正常肝組織僅見輕微的、可恢復(fù)的炎癥，未見壞死。
近，Kanai等報(bào)道選擇甲胎蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，構(gòu)建重組腺病毒載體AdAFP-CD和AdAFP-Lacz，分別轉(zhuǎn)染AFP+的肝癌細(xì)胞系和AFP-的肝癌細(xì)胞系，結(jié)果顯示：在前者，目的基因轉(zhuǎn)移效率顯著提高，5-FC的IC50為136.6μmol，而后者的IC50達(dá)24651μmol。
胰腺癌癌基因ERBB2在多種腫瘤尤其在胰腺癌、乳腺癌等腫瘤組織中呈高表達(dá)，而在正常和炎癥胰腺組織未見這種高表達(dá)，因此，Harris等以ERBB2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列中一含544個(gè)堿基對的DNA片段啟動(dòng)CD基因，選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞HPAF、Panc1和乳腺癌細(xì)胞T3M4，HPAF細(xì)胞呈高表達(dá)、Panc1細(xì)胞呈中度表達(dá)、而T3M4細(xì)胞不表達(dá)ERBB2。檢測結(jié)果表明未轉(zhuǎn)染的上述三種細(xì)胞檢測不出CD酶活性，而轉(zhuǎn)染后其CD酶活性分別為每分鐘958.3、344.5和0pmol/109(每分鐘109細(xì)胞產(chǎn)生尿嘧啶的微摩爾量）。在前兩組，給予5-FC后，轉(zhuǎn)染CD的胰腺癌細(xì)胞生長明顯受抑，而在T3M4組，細(xì)胞生長則未見明顯改變。近來，Evoy等報(bào)道選用腺病毒載體，成功將CD基因轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，同樣在體內(nèi)、體外觀察到明顯的抗腫瘤效應(yīng)。
胃癌大約40%的胃癌表達(dá)CEA，Lan等采用CEA啟動(dòng)子作為靶向性因子，構(gòu)建了重組病毒載體AdCEA-Lacz和AdCEA-CD，分別轉(zhuǎn)染CEA陽性胃癌細(xì)胞系MKN45、MKN28和CEA陰性胃癌細(xì)胞MKN1，體內(nèi)和體外試驗(yàn)顯示Lacz基因選擇性只在CEA陽性胃癌細(xì)胞中表達(dá)；另外，AdCEA-CD轉(zhuǎn)導(dǎo)后上述三類細(xì)胞對5-FC的敏感性各有不同，5-FC的IC50分別是88、307和16935μmol，細(xì)胞對5-FC的敏感性分別提高了73、267和1.1倍。
結(jié)語
無論是RV還是Ad載體，均不是理想的基因轉(zhuǎn)移載體，設(shè)計(jì)安全、高效、穩(wěn)定、特異、可控、簡便易行并可攜帶不同長度DNA的新載體仍是基因治療研究中急待解決的問題；另外，綜觀某些文獻(xiàn)，對照組設(shè)置均為各種腫瘤細(xì)胞，缺乏腫瘤細(xì)胞與骨髓細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和生殖細(xì)胞等化療藥物敏感組織細(xì)胞的比較，研究基因治療腫瘤的目的不是為了比較各種腫瘤細(xì)胞間的差異，而應(yīng)比較腫瘤與癌旁組織和其它正常組織細(xì)胞間的差異；再者，某些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚難確定其對實(shí)驗(yàn)性腫瘤具有治療作用亦或預(yù)防作用。
盡管如此，現(xiàn)有的研究已證實(shí)CD基因治療的廣泛性和有效性，并且，由于5-FC和5-FC在臨床上使用廣泛，藥代動(dòng)力學(xué)亦較清楚，可采用成熟的檢測手段證實(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果和避免藥物過量所致的損傷作用。當(dāng)前，CD基因治療消化道腫瘤的發(fā)展趨勢為采用組織特異性調(diào)控元件作為細(xì)胞靶向性因子提高轉(zhuǎn)導(dǎo)的選擇性，而新的生物治療模式如聯(lián)合基因治療或者設(shè)計(jì)以CD基因?yàn)榛A(chǔ)的瘤苗進(jìn)行基因免疫治療將是未來研究的重要方向。
胞嘧啶脫氨酶基因?qū)肽[瘤細(xì)胞可將無毒性的原藥在腫瘤細(xì)胞內(nèi)代謝為具細(xì)胞毒的產(chǎn)物而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本文綜述了該基因的克隆、作用機(jī)制和在消化道腫瘤治療中的研究進(jìn)展。
隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，基因治療這一嶄新方法盡管還多處于實(shí)驗(yàn)研究手段，卻已顯示出良好的應(yīng)用前景。自1991年Huber等提出病毒導(dǎo)向的酶解原藥療法以來，有關(guān)的基因研究成為熱門課題。目前，一個(gè)新的基因治療系統(tǒng)——EC-CD/5-FC系統(tǒng)正日益受到高度關(guān)注。本文就胞嘧啶脫氨酶基因治療消化道腫瘤的現(xiàn)狀作一綜述。
CD基因的克隆
胞嘧啶脫氨酶是大腸桿菌代謝旁路中的一種酶，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不含該酶。Austin等于1992年首先從大腸桿菌株中采用傳統(tǒng)方法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)一步分離、純化并轉(zhuǎn)染宿主菌，初步構(gòu)建成原核細(xì)胞中表達(dá)的CD質(zhì)粒載體，克隆了編碼CD的大腸桿菌基因，利用陽性基因篩選方法，獲得一攜帶10.8kb的DNA插入質(zhì)粒，其中一3kb的DNA片段保留有CD酶活性。CK蛋白質(zhì)分子量為52000，DNA序列分析顯示一含427個(gè)氨基酸開放讀碼框架編碼CD。
為證實(shí)CD基因在真核細(xì)胞中表達(dá)以發(fā)揮作用，研究者采用寡核苷酸突變技術(shù)，將CD基因起始密碼子由GTG→ATG，從而產(chǎn)生一5’起始密碼子，選擇pRc/CMV真核表達(dá)載體，構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV/CD-1。以脂質(zhì)體法將pCMV/CD-1導(dǎo)入人結(jié)腸癌WiDr細(xì)胞系，生長抑制試驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FC的IC50為30μmol，而未轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞其IC50為17000μmol，表明轉(zhuǎn)染有CD基因的結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FC的敏感性提高了近560倍。
CD基因轉(zhuǎn)移方法
安全有效的基因轉(zhuǎn)移方法是基因治療的關(guān)鍵因素之一。至今，作為基因轉(zhuǎn)移的載體，以病毒性載體介導(dǎo)的方法研究為系統(tǒng)深入，幾乎應(yīng)用于所有的靶系統(tǒng)。在消化道腫瘤的CD基因治療中，既往的研究仍選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這與對其基因組結(jié)構(gòu)和生活周期了解得較清楚有關(guān)。RV載體大多由Moloney小鼠白血病病毒構(gòu)建而成，為RNA病毒，基因組編碼在一條單鏈RNA分子上，進(jìn)入細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，此DNA進(jìn)入細(xì)胞核整合在受體細(xì)胞DNA上，并以此為模板合成病毒基因和后代RNA。采用RV轉(zhuǎn)導(dǎo)CD基因，將CD基因整合于病毒長末端重復(fù)的末端，因而整合后的病毒基因結(jié)構(gòu)可受到保護(hù)不致受損。
目前轉(zhuǎn)導(dǎo)CD基因多選擇腺病毒載體。由于腺病毒為一雙鏈DNA病毒，宿主范圍廣泛，尤其能有效地感染非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，另外，它不能整合到宿主細(xì)胞染色體上，因而較逆轉(zhuǎn)錄病毒更為安全。重組腺病毒載體主要來自于2型和5型腺病毒，容量大，可裝載達(dá)7.6kb。已有學(xué)者選用Ad載體介導(dǎo)CD基因轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌HT29細(xì)胞系，將攜帶有大腸桿菌標(biāo)記基因的腺病毒注射到腫瘤組織中底物X-gal染色來判斷基因轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示外源基因經(jīng)單次注入后近5%-30%的腫瘤組織表達(dá)Lacz基因。
作用機(jī)制
由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在CD，因而不能將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，更不能將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成5-氟尿嘧啶。但通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將CD基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，則哺乳動(dòng)物細(xì)胞可將一些原來無毒性的原藥轉(zhuǎn)化為有細(xì)胞毒性的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞自殺性死亡。5-FC在高度抗微生物活性的濃度下對哺乳動(dòng)物無毒性作用，經(jīng)CD脫氨為5-FU，后者則具有高度細(xì)胞毒性，為臨床廣泛使用的抗腫瘤化療藥物。
CD基因作用的一個(gè)十分突出特點(diǎn)即所謂的“旁觀者效應(yīng)”，這與某些自殺基因的作用機(jī)制相似。Hirschowitz等早觀察到CD基因治療結(jié)腸癌時(shí)的這一效應(yīng)，當(dāng)CD+的結(jié)腸癌細(xì)胞與CD-的結(jié)腸癌細(xì)胞混合時(shí)，比較了CD+的細(xì)胞比例為10%和100%時(shí)兩者的細(xì)胞生長抑制水平，結(jié)果無顯著性差異。對旁觀者效應(yīng)尚缺乏確切的解釋，但大多同意“縫隙連接”引起旁觀者效應(yīng)，通過細(xì)胞間的接觸，毒性代謝產(chǎn)物由“縫隙連接”從CD+的細(xì)胞轉(zhuǎn)入CD-的細(xì)胞，從而使得后者變得原藥也敏感了，并被原藥代謝產(chǎn)物殺死。但亦有學(xué)者提出不同意見，Trinh等通過電鏡發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織鄰近區(qū)域有大量的“橋?！贝嬖?，因其起著封閉細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，推測旁觀者效應(yīng)并非上述機(jī)制，尚有其它機(jī)制參與，如細(xì)胞凋亡、原藥代謝產(chǎn)物本身可穿過細(xì)胞膜等可能機(jī)制。
幾種消化道腫瘤CD基因治療現(xiàn)狀
結(jié)腸癌CD基因治療的研究對象以結(jié)腸癌為多。Huber等觀察到*鼠5-FC的半衰腸期大約是40分鐘，腹腔內(nèi)給予500mg/的5-FC，其血漿水平可維持在4000μmol。體外試驗(yàn)顯示：對于CD+結(jié)腸癌細(xì)胞，5-FC的IC50僅為5μmol；而體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明無論是腹腔內(nèi)還是靜脈內(nèi)給予5-FC，都同樣觀察到明顯的抗腫瘤效應(yīng)。
Richard等將組織特異性因子癌胚抗原轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的三個(gè)部分分別插入到含CD基因的pCMV/CD-1中，構(gòu)建了一系列pCEA/CD基因載體，通過分析熒光素活性，篩選出活性高的pCEA/CD-145基因。體外實(shí)驗(yàn)將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸癌NCIH508細(xì)胞中，在5-FC存在下，基因表達(dá)發(fā)揮出良好的原藥轉(zhuǎn)換抗腫瘤效應(yīng)，CD+的NCIH508細(xì)胞其IC50＜2μmol，而CD－的NCIH508細(xì)胞其IC50達(dá)516μmol。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)比較轉(zhuǎn)導(dǎo)前后的大腸癌細(xì)胞*鼠體內(nèi)成瘤后，給予5-FU500μg(kgd，），連續(xù)20日，細(xì)果顯示未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD的大腸癌細(xì)胞成瘤*鼠腫瘤重量增加了近3倍，而轉(zhuǎn)導(dǎo)CD的大腸癌細(xì)胞成瘤*鼠腫瘤重量基本未改變。
肝腫瘤肝原發(fā)或繼發(fā)腫瘤的基因治療研究報(bào)道多。由于肝臟是結(jié)腸癌常轉(zhuǎn)移的部位，因此，Ohwada等在建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，給予人結(jié)腸癌荷瘤*鼠肝內(nèi)注射AdCMV.CD和腹腔內(nèi)每周二次給予5-FC，以點(diǎn)雜交分析肝內(nèi)人結(jié)腸癌細(xì)胞DNA數(shù)量來判斷抑制轉(zhuǎn)移瘤效果。結(jié)果與對照組相比，治療組肝內(nèi)人結(jié)腸癌細(xì)胞DNA數(shù)量顯著低于各對照組，級組織學(xué)檢查顯示治療組注射部位肝腫瘤出現(xiàn)壞死，對照組未見此現(xiàn)象，且治療組中正常肝組織僅見輕微的、可恢復(fù)的炎癥，未見壞死。
近，Kanai等報(bào)道選擇甲胎蛋白啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，構(gòu)建重組腺病毒載體AdAFP-CD和AdAFP-Lacz，分別轉(zhuǎn)染AFP+的肝癌細(xì)胞系和AFP-的肝癌細(xì)胞系，結(jié)果顯示：在前者，目的基因轉(zhuǎn)移效率顯著提高，5-FC的IC50為136.6μmol，而后者的IC50達(dá)24651μmol。
胰腺癌癌基因ERBB2在多種腫瘤尤其在胰腺癌、乳腺癌等腫瘤組織中呈高表達(dá)，而在正常和炎癥胰腺組織未見這種高表達(dá)，因此，Harris等以ERBB2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列中一含544個(gè)堿基對的DNA片段啟動(dòng)CD基因，選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞HPAF、Panc1和乳腺癌細(xì)胞T3M4，HPAF細(xì)胞呈高表達(dá)、Panc1細(xì)胞呈中度表達(dá)、而T3M4細(xì)胞不表達(dá)ERBB2。檢測結(jié)果表明未轉(zhuǎn)染的上述三種細(xì)胞檢測不出CD酶活性，而轉(zhuǎn)染后其CD酶活性分別為每分鐘958.3、344.5和0pmol/109(每分鐘109細(xì)胞產(chǎn)生尿嘧啶的微摩爾量）。在前兩組，給予5-FC后，轉(zhuǎn)染CD的胰腺癌細(xì)胞生長明顯受抑，而在T3M4組，細(xì)胞生長則未見明顯改變。近來，Evoy等報(bào)道選用腺病毒載體，成功將CD基因轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，同樣在體內(nèi)、體外觀察到明顯的抗腫瘤效應(yīng)。
胃癌大約40%的胃癌表達(dá)CEA，Lan等采用CEA啟動(dòng)子作為靶向性因子，構(gòu)建了重組病毒載體AdCEA-Lacz和AdCEA-CD，分別轉(zhuǎn)染CEA陽性胃癌細(xì)胞系MKN45、MKN28和CEA陰性胃癌細(xì)胞MKN1，體內(nèi)和體外試驗(yàn)顯示Lacz基因選擇性只在CEA陽性胃癌細(xì)胞中表達(dá)；另外，AdCEA-CD轉(zhuǎn)導(dǎo)后上述三類細(xì)胞對5-FC的敏感性各有不同，5-FC的IC50分別是88、307和16935μmol，細(xì)胞對5-FC的敏感性分別提高了73、267和1.1倍。
結(jié)語
無論是RV還是Ad載體，均不是理想的基因轉(zhuǎn)移載體，設(shè)計(jì)安全、高效、穩(wěn)定、特異、可控、簡便易行并可攜帶不同長度DNA的新載體仍是基因治療研究中急待解決的問題；另外，綜觀某些文獻(xiàn)，對照組設(shè)置均為各種腫瘤細(xì)胞，缺乏腫瘤細(xì)胞與骨髓細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和生殖細(xì)胞等化療藥物敏感組織細(xì)胞的比較，研究基因治療腫瘤的目的不是為了比較各種腫瘤細(xì)胞間的差異，而應(yīng)比較腫瘤與癌旁組織和其它正常組織細(xì)胞間的差異；再者，某些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚難確定其對實(shí)驗(yàn)性腫瘤具有治療作用亦或預(yù)防作用。
盡管如此，現(xiàn)有的研究已證實(shí)CD基因治療的廣泛性和有效性，并且，由于5-FC和5-FC在臨床上使用廣泛，藥代動(dòng)力學(xué)亦較清楚，可采用成熟的檢測手段證實(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果和避免藥物過量所致的損傷作用。當(dāng)前，CD基因治療消化道腫瘤的發(fā)展趨勢為采用組織特異性調(diào)控元件作為細(xì)胞靶向性因子提高轉(zhuǎn)導(dǎo)的選擇性，而新的生物治療模式如聯(lián)合基因治療或者設(shè)計(jì)以CD基因?yàn)榛A(chǔ)的瘤苗進(jìn)行基因免疫治療將是未來研究的重要方向。