【摘要】 目的 檢測特異性人免疫球蛋白的制品相應(yīng)抗體含量變化情況。方法 采用留樣觀察法和加速試驗(yàn)法對不同溫度條件下的特異性人免疫球蛋白有效期進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果 乙型肝炎人免疫球蛋白（HBTG）和破傷風(fēng)人免疫球蛋白（TIG）于2℃～8℃存放時(shí)較為穩(wěn)定，分別是放置3年、1年所檢測的各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化。結(jié)論 特異性人免疫球蛋白的有效期確定應(yīng)以常規(guī)觀察測得的結(jié)果為最可靠的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】 特異性人免疫球蛋白 HBIG TIG 穩(wěn)定性試驗(yàn)
特異性人免疫球蛋白是用疫苗或毒素免疫人體使其血漿產(chǎn)生高效價(jià)抗體，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法制備并經(jīng)低pH放孵病毒滅活處理的特異性免疫球蛋白制劑，與抗毒素及抗血清相比，特異性人免疫球蛋白在使用過程中不會(huì)發(fā)生因注射異種蛋白而產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，其抗體在患者體內(nèi)維持時(shí)間較長。隨著我國醫(yī)療及健康水平的不斷提高，特異性人免疫球蛋白在臨床上的使用越來越受到關(guān)注［1,2］。特異性人免疫球蛋白主要使用成分是IgG，含有針對各種不同抗原的抗體，本文對其穩(wěn)定性的觀察是以抗體活性變化作為主要考察指標(biāo)，并以HBIG、TIG兩種制品為代表，通過制品在不同溫度下放置一定時(shí)間后，檢測其抗體效價(jià)等項(xiàng)指標(biāo)的變化來了解制品的穩(wěn)定性，以確定其有效期，現(xiàn)將有關(guān)試驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 特異性人免疫球蛋白（HBIG、TIG） 均由蘭州生物制品研究所采用低溫乙醇工藝結(jié)合低pH放孵滅活病毒步驟制備而成（批號分別為HBIG：20030701、20030702、20030703，200IU/支；TIG：20070401、20070402、20070403，250IU/支，均為液體劑型）。
1．1．2 乙型肝炎表面抗體 抗-HBs放射免疫分析試劑盒：3V診斷技術(shù)公司提供。
1．1．3 抗-HBs、TIG標(biāo)準(zhǔn)品 均由中國藥品生物制品檢定所提供。
1．1．4 儀器設(shè)備 γ-計(jì)數(shù)器，2008G型，國營二六二廠生產(chǎn)；HPLC色譜柱：日本產(chǎn)G3000SW，規(guī)格7.5mm×300mm；紫外可見分光光度計(jì)：U-2001，日本日立公司。
1．2 方法
1．2．1 抗-HBs效價(jià) 按2000年版《中國生物制品規(guī)程》制定，各樣品測定均重復(fù)1次，按均值計(jì)算。
1．2．2 抗-TT效價(jià) 按《中華人民共和國藥典》2005年版（三部）附錄ⅪF破傷風(fēng)抗毒素效價(jià)測定法進(jìn)行，并將其檢測結(jié)果與ELISA法測定結(jié)果進(jìn)行比較。
1．2．3 HBIG、TIG的單體加二聚體的檢查 均按《中華人民共和國藥典》2005年版（三部）的要求進(jìn)行。
1．2．4 留樣觀察法 將蘭州生物制品研究所制備的HBIG制品置于2℃～8℃、（24±1）℃、（37±1）℃，分別于0、3、6、12、18、24及36個(gè)月取出，檢測其有關(guān)質(zhì)量指標(biāo)，同樣將上述來源的破傷風(fēng)人免疫球蛋白的（TIG）置于（6±2）℃，于0、3、6、9、12個(gè)月取樣，置于（25±2）℃，于0、1、2、3、6個(gè)月取樣，檢測其有關(guān)質(zhì)量指標(biāo)。
2 結(jié)果
2．1 抗體效價(jià)
2．1．1 抗-HBs效價(jià) 乙型肝炎人免疫球蛋白的抗-HBs效價(jià)在不同放置條件下的變化結(jié)果。結(jié)果顯示，制品在2℃～8℃存放3年時(shí)，抗-HBs效價(jià)無明顯改變，在（24±1）℃存放1年半時(shí)，抗-HBs效價(jià)平均下降 32.8%，在（37±1）℃存放3個(gè)月后，抗-HBs效價(jià)開始明顯降低。表1 HBIG在不同放置條件下的抗-HBs效價(jià)
2．1．2 抗-TT效價(jià) 破傷風(fēng)人免疫球蛋白的抗-TT效價(jià)在不同放置條件下的變化結(jié)果，結(jié)果顯示，該制品在（6±2）℃存放1年時(shí)，破傷風(fēng)抗體效價(jià)無明顯改變；在（25±2）℃存放半年時(shí)，破傷風(fēng)抗體效價(jià)平均下降10.41%。
2．2 IgG單體加雙體 特異性人免疫球蛋白中的IgG易于聚合，其中HBIG在2℃～8℃存放3年后，IgG單體加雙體平均下降了1.26%；TIG在（6±2）℃存放1年后，IgG單體加雙體平均下降了1.14%。但上述兩種制品在（24±1）℃存放6個(gè)月后單體加雙體的總和開始明顯下降，其變化情況分別 TIG在不同放置條件下的抗-TT效價(jià)表3 HBIG IgG單體加雙體在不同條件下放置后的變化表4 TIG IgG單體加雙體在不同條件下放置后的變化
2．3 蛋白質(zhì)含量及純度 HBIG、TIG蛋白質(zhì)含量及純度的穩(wěn)定性分別。從中的情況反映出，HBIG樣品在不同溫度下［2℃～8℃、（24±1）℃、（37±1）℃］分別放置1年、2年及3年時(shí)，TIG樣品在（6±2）℃和（25±2）℃下分別放置半年和1年時(shí)，蛋白質(zhì)含量和純度基本上沒有發(fā)生改變，均說明這兩項(xiàng)指標(biāo)較為穩(wěn)定。 表5 HBIG不同放置條件蛋白質(zhì)含量變化情況 表6 HBIG不同放置條件下蛋白質(zhì)純度變化表7 TIG不同放置條件蛋白質(zhì)含量變化情況表8 TIG不同放置條件下蛋白質(zhì)純度變化
3 討論
生物制品穩(wěn)定性試驗(yàn)，長期以來大多采用留樣觀察法，此法是在不同溫度下放置考察藥物制劑的穩(wěn)定性，是考察藥物穩(wěn)定性的最可靠方法，能準(zhǔn)確真實(shí)地反映制品穩(wěn)定性的實(shí)際情況。本文進(jìn)行的穩(wěn)定性試驗(yàn)的方法依據(jù)《中華人民共和國藥典》2005年版附錄ⅪⅩC“原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”，在人免疫球蛋白、靜注人免疫球蛋白（pH 4）穩(wěn)定性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)樣品在（25±2）℃條件下放置6個(gè)月進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，在（6±2）℃條件下放置12個(gè)月、18個(gè)月、36個(gè)月進(jìn)行長期試驗(yàn)，分別檢測特異性人免疫球蛋白樣品外觀、pH值、抗體效價(jià)、純度、蛋白質(zhì)含量、IgG單體加雙體、無菌檢查、熱原質(zhì)檢查等多項(xiàng)指標(biāo)，以觀察其理化及生物學(xué)活性的變化情況，為確定此產(chǎn)品的有效期。
特異性人免疫球蛋白有別于其他藥物制劑，其分子量為15萬左右，因其作用成分為蛋白質(zhì)，易受各種物理或化學(xué)因素的影響而出現(xiàn)裂解、聚合、變性等變化，造成其生物學(xué)功能下降或損失，從而使療效降低甚至失效，因此應(yīng)用上述方法進(jìn)行特異性人免疫球蛋白穩(wěn)定性觀察，對制品有效期的確定也僅是提供參考數(shù)據(jù)。其有效期確定還應(yīng)以常規(guī)留樣觀察法測定的穩(wěn)定性結(jié)果作為主要依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】 特異性人免疫球蛋白 HBIG TIG 穩(wěn)定性試驗(yàn)
特異性人免疫球蛋白是用疫苗或毒素免疫人體使其血漿產(chǎn)生高效價(jià)抗體，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法制備并經(jīng)低pH放孵病毒滅活處理的特異性免疫球蛋白制劑，與抗毒素及抗血清相比，特異性人免疫球蛋白在使用過程中不會(huì)發(fā)生因注射異種蛋白而產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，其抗體在患者體內(nèi)維持時(shí)間較長。隨著我國醫(yī)療及健康水平的不斷提高，特異性人免疫球蛋白在臨床上的使用越來越受到關(guān)注［1,2］。特異性人免疫球蛋白主要使用成分是IgG，含有針對各種不同抗原的抗體，本文對其穩(wěn)定性的觀察是以抗體活性變化作為主要考察指標(biāo)，并以HBIG、TIG兩種制品為代表，通過制品在不同溫度下放置一定時(shí)間后，檢測其抗體效價(jià)等項(xiàng)指標(biāo)的變化來了解制品的穩(wěn)定性，以確定其有效期，現(xiàn)將有關(guān)試驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料與方法
1．1 材料
1．1．1 特異性人免疫球蛋白（HBIG、TIG） 均由蘭州生物制品研究所采用低溫乙醇工藝結(jié)合低pH放孵滅活病毒步驟制備而成（批號分別為HBIG：20030701、20030702、20030703，200IU/支；TIG：20070401、20070402、20070403，250IU/支，均為液體劑型）。
1．1．2 乙型肝炎表面抗體 抗-HBs放射免疫分析試劑盒：3V診斷技術(shù)公司提供。
1．1．3 抗-HBs、TIG標(biāo)準(zhǔn)品 均由中國藥品生物制品檢定所提供。
1．1．4 儀器設(shè)備 γ-計(jì)數(shù)器，2008G型，國營二六二廠生產(chǎn)；HPLC色譜柱：日本產(chǎn)G3000SW，規(guī)格7.5mm×300mm；紫外可見分光光度計(jì)：U-2001，日本日立公司。
1．2 方法
1．2．1 抗-HBs效價(jià) 按2000年版《中國生物制品規(guī)程》制定，各樣品測定均重復(fù)1次，按均值計(jì)算。
1．2．2 抗-TT效價(jià) 按《中華人民共和國藥典》2005年版（三部）附錄ⅪF破傷風(fēng)抗毒素效價(jià)測定法進(jìn)行，并將其檢測結(jié)果與ELISA法測定結(jié)果進(jìn)行比較。
1．2．3 HBIG、TIG的單體加二聚體的檢查 均按《中華人民共和國藥典》2005年版（三部）的要求進(jìn)行。
1．2．4 留樣觀察法 將蘭州生物制品研究所制備的HBIG制品置于2℃～8℃、（24±1）℃、（37±1）℃，分別于0、3、6、12、18、24及36個(gè)月取出，檢測其有關(guān)質(zhì)量指標(biāo)，同樣將上述來源的破傷風(fēng)人免疫球蛋白的（TIG）置于（6±2）℃，于0、3、6、9、12個(gè)月取樣，置于（25±2）℃，于0、1、2、3、6個(gè)月取樣，檢測其有關(guān)質(zhì)量指標(biāo)。
2 結(jié)果
2．1 抗體效價(jià)
2．1．1 抗-HBs效價(jià) 乙型肝炎人免疫球蛋白的抗-HBs效價(jià)在不同放置條件下的變化結(jié)果。結(jié)果顯示，制品在2℃～8℃存放3年時(shí)，抗-HBs效價(jià)無明顯改變，在（24±1）℃存放1年半時(shí)，抗-HBs效價(jià)平均下降 32.8%，在（37±1）℃存放3個(gè)月后，抗-HBs效價(jià)開始明顯降低。表1 HBIG在不同放置條件下的抗-HBs效價(jià)
2．1．2 抗-TT效價(jià) 破傷風(fēng)人免疫球蛋白的抗-TT效價(jià)在不同放置條件下的變化結(jié)果，結(jié)果顯示，該制品在（6±2）℃存放1年時(shí)，破傷風(fēng)抗體效價(jià)無明顯改變；在（25±2）℃存放半年時(shí)，破傷風(fēng)抗體效價(jià)平均下降10.41%。
2．2 IgG單體加雙體 特異性人免疫球蛋白中的IgG易于聚合，其中HBIG在2℃～8℃存放3年后，IgG單體加雙體平均下降了1.26%；TIG在（6±2）℃存放1年后，IgG單體加雙體平均下降了1.14%。但上述兩種制品在（24±1）℃存放6個(gè)月后單體加雙體的總和開始明顯下降，其變化情況分別 TIG在不同放置條件下的抗-TT效價(jià)表3 HBIG IgG單體加雙體在不同條件下放置后的變化表4 TIG IgG單體加雙體在不同條件下放置后的變化
2．3 蛋白質(zhì)含量及純度 HBIG、TIG蛋白質(zhì)含量及純度的穩(wěn)定性分別。從中的情況反映出，HBIG樣品在不同溫度下［2℃～8℃、（24±1）℃、（37±1）℃］分別放置1年、2年及3年時(shí)，TIG樣品在（6±2）℃和（25±2）℃下分別放置半年和1年時(shí)，蛋白質(zhì)含量和純度基本上沒有發(fā)生改變，均說明這兩項(xiàng)指標(biāo)較為穩(wěn)定。 表5 HBIG不同放置條件蛋白質(zhì)含量變化情況 表6 HBIG不同放置條件下蛋白質(zhì)純度變化表7 TIG不同放置條件蛋白質(zhì)含量變化情況表8 TIG不同放置條件下蛋白質(zhì)純度變化
3 討論
生物制品穩(wěn)定性試驗(yàn)，長期以來大多采用留樣觀察法，此法是在不同溫度下放置考察藥物制劑的穩(wěn)定性，是考察藥物穩(wěn)定性的最可靠方法，能準(zhǔn)確真實(shí)地反映制品穩(wěn)定性的實(shí)際情況。本文進(jìn)行的穩(wěn)定性試驗(yàn)的方法依據(jù)《中華人民共和國藥典》2005年版附錄ⅪⅩC“原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”，在人免疫球蛋白、靜注人免疫球蛋白（pH 4）穩(wěn)定性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)樣品在（25±2）℃條件下放置6個(gè)月進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，在（6±2）℃條件下放置12個(gè)月、18個(gè)月、36個(gè)月進(jìn)行長期試驗(yàn)，分別檢測特異性人免疫球蛋白樣品外觀、pH值、抗體效價(jià)、純度、蛋白質(zhì)含量、IgG單體加雙體、無菌檢查、熱原質(zhì)檢查等多項(xiàng)指標(biāo)，以觀察其理化及生物學(xué)活性的變化情況，為確定此產(chǎn)品的有效期。
特異性人免疫球蛋白有別于其他藥物制劑，其分子量為15萬左右，因其作用成分為蛋白質(zhì)，易受各種物理或化學(xué)因素的影響而出現(xiàn)裂解、聚合、變性等變化，造成其生物學(xué)功能下降或損失，從而使療效降低甚至失效，因此應(yīng)用上述方法進(jìn)行特異性人免疫球蛋白穩(wěn)定性觀察，對制品有效期的確定也僅是提供參考數(shù)據(jù)。其有效期確定還應(yīng)以常規(guī)留樣觀察法測定的穩(wěn)定性結(jié)果作為主要依據(jù)。