分子排阻色譜法是根據(jù)分子大小進行分離的一種液相色譜技術(shù)。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經(jīng)修飾凝膠如葡聚糖凝膠Sephadex和聚丙烯酰胺凝膠Sepherose等為填充劑，這些填充劑表面分布著不同尺寸的孔徑，藥物分子進入色譜柱后，它們中的不同組分按其大小進入相應(yīng)的孔徑內(nèi)，大小大于所有孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內(nèi)部，在色譜過程中不被保留，最早被流動相洗脫至柱外，表現(xiàn)為保留時間較短；大小小于所有孔徑的分子能自由進入填充劑表面的所有孔徑，在柱子中滯留時間較長，表現(xiàn)為保留時間較長；其余分子則按分子大小依次被洗脫。
1．對儀器的一般要求來源:考試大
分子排阻色譜法所需的進樣器和檢測器同高效液相色譜法，液相色譜泵一般分常壓、中壓和高壓。在藥物分析中尤其是分子量或分子量分布通常采用高效分子排阻色譜法（HPSEC）。應(yīng)選用與供試品分子大小相適應(yīng)的色譜柱填充劑。使用的流動相通常為水溶液或緩沖液，溶液的pH值不宜超出填充劑的耐受力，一般pH值在2～8范圍。流動相中可進入適量的有機溶劑，但不宜過濃，一般不應(yīng)超過30%，流速不宜過高，一般為0.5～1.0ml/min.
2．系統(tǒng)適用性試驗
高效分子排阻色譜法的系統(tǒng)適用性試驗中（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）、（2）分離度、（3）重復(fù)性、（4）拖尾因子的測定方法，在一般情況下，同高效液相色譜法項下方法，但在高分子雜質(zhì)檢查時，某些藥物分子的單體與其二聚體不能達到基線分離時，其分離度的計算公式為：
除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)小于2.0。
3．測定法
（1）分子量測定法
按各品種項下規(guī)定的方法，一般適用蛋白質(zhì)多肽的分子量測定。選用與供試品分子大小相適宜的色譜柱和適宜分子量范圍的對照品，除另有規(guī)定外，對照品與供試品均需使用二硫蘇糖醇（DTT）和十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，以打開分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，并使分子的構(gòu)型與構(gòu)象趨于一致，經(jīng)處理的蛋白質(zhì)和多肽分子通常以線性形式分離，以對照品分子量（MW）的對數(shù)對相應(yīng)的保留時間（tR）制得標準曲線的線性回歸方程logMW=a+b tR，供試品以保留時間由標準曲線回歸方程計算其分子量或亞基的分子量。
（2）生物大分子聚合物分子量與分子量分布的測定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和膠原蛋白等具有分子大小不均一的特點，故生物大分子聚合物分子量與分子量分布是控制該類產(chǎn)品的關(guān)鍵指標。在生物大分子聚合物分子量與分子量分布測定時，選用與供試品分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相同或相似的對照品十分重要。
按各品種項下規(guī)定的方法，除另有規(guī)定外，同樣采用分子量對照品和適宜的GPC軟件制得對照品重均分子量（MW）的對數(shù)對相應(yīng)的保留時間（tR）制得標準曲線的線性回歸方程logMW=a+btR，供試品采用適宜的GPC軟件處理結(jié)果，并按下列公式計算出供試品的分子量與分子量分布。
Mn=∑RIi/∑（RIi/Mi）
MW=∑（RIiMi）i/∑RI
D=MW/Mn
式中Mn為數(shù)均分子量；
MW為重均分子量；
D為分布系數(shù)；
RIi為供試品在保留時間i時的峰高；
Mi為供試品在保留時間時的分子量。
（3）高分子雜質(zhì)測定法
高分子雜質(zhì)系指藥品中分子量大于藥物分子的雜質(zhì)，通常是藥物在生產(chǎn)或貯存過程中產(chǎn)生的高分子聚合物和生產(chǎn)過程中未除盡的可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)的高分子物質(zhì)。
在正文品種規(guī)定的色譜條件下進行分離。
定量方法
①主成分自身對照法同高效液相色譜法項下規(guī)定。一般用于高分子雜質(zhì)含量較低的品種。
②面積歸一化法同高效液相色譜法項下規(guī)定。
③限量法除另有規(guī)定外，規(guī)定不得檢出保留時間小于對照品保留時間的組分，一般用于混合物中高分子物質(zhì)的控制。
④自身對照外標法一般用于SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)的檢查。在該分離系統(tǒng)中，除部分寡聚物外，β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)在色譜過程中均不保留，即所有的高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，以藥物自身為對照品，按外標法計算藥品中高分子雜質(zhì)的相對百分含量。
［附注］SephadexG-10的處理方法。
色譜柱的填裝裝柱前先將約15g葡聚糖凝膠SephadexG-10用水浸泡48小時，使之充分溶脹，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入玻璃柱，一次性裝滿，然后用水將附著玻璃管壁的SephadexG-10洗下，使色譜柱面平整，新填裝的色譜柱要先用水連續(xù)沖洗4～6小時，以排出柱中的氣泡。
樣品的加入進樣可以采用自動進樣閥，也可以直接將樣品加在床的表面（此時，先將床表面的流動相吸干，將樣品溶液沿著色譜管壁轉(zhuǎn)圈緩緩加入，注意勿使填充劑翻起，待之隨著重力的作用滲入固定相后，再沿著色譜管壁轉(zhuǎn)圈緩緩加入3～5mL流動相，以洗下殘留在色譜管壁的樣品溶液）。
1．對儀器的一般要求來源:考試大
分子排阻色譜法所需的進樣器和檢測器同高效液相色譜法，液相色譜泵一般分常壓、中壓和高壓。在藥物分析中尤其是分子量或分子量分布通常采用高效分子排阻色譜法（HPSEC）。應(yīng)選用與供試品分子大小相適應(yīng)的色譜柱填充劑。使用的流動相通常為水溶液或緩沖液，溶液的pH值不宜超出填充劑的耐受力，一般pH值在2～8范圍。流動相中可進入適量的有機溶劑，但不宜過濃，一般不應(yīng)超過30%，流速不宜過高，一般為0.5～1.0ml/min.
2．系統(tǒng)適用性試驗
高效分子排阻色譜法的系統(tǒng)適用性試驗中（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）、（2）分離度、（3）重復(fù)性、（4）拖尾因子的測定方法，在一般情況下，同高效液相色譜法項下方法，但在高分子雜質(zhì)檢查時，某些藥物分子的單體與其二聚體不能達到基線分離時，其分離度的計算公式為：
除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)小于2.0。
3．測定法
（1）分子量測定法
按各品種項下規(guī)定的方法，一般適用蛋白質(zhì)多肽的分子量測定。選用與供試品分子大小相適宜的色譜柱和適宜分子量范圍的對照品，除另有規(guī)定外，對照品與供試品均需使用二硫蘇糖醇（DTT）和十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，以打開分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，并使分子的構(gòu)型與構(gòu)象趨于一致，經(jīng)處理的蛋白質(zhì)和多肽分子通常以線性形式分離，以對照品分子量（MW）的對數(shù)對相應(yīng)的保留時間（tR）制得標準曲線的線性回歸方程logMW=a+b tR，供試品以保留時間由標準曲線回歸方程計算其分子量或亞基的分子量。
（2）生物大分子聚合物分子量與分子量分布的測定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和膠原蛋白等具有分子大小不均一的特點，故生物大分子聚合物分子量與分子量分布是控制該類產(chǎn)品的關(guān)鍵指標。在生物大分子聚合物分子量與分子量分布測定時，選用與供試品分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相同或相似的對照品十分重要。
按各品種項下規(guī)定的方法，除另有規(guī)定外，同樣采用分子量對照品和適宜的GPC軟件制得對照品重均分子量（MW）的對數(shù)對相應(yīng)的保留時間（tR）制得標準曲線的線性回歸方程logMW=a+btR，供試品采用適宜的GPC軟件處理結(jié)果，并按下列公式計算出供試品的分子量與分子量分布。
Mn=∑RIi/∑（RIi/Mi）
MW=∑（RIiMi）i/∑RI
D=MW/Mn
式中Mn為數(shù)均分子量；
MW為重均分子量；
D為分布系數(shù)；
RIi為供試品在保留時間i時的峰高；
Mi為供試品在保留時間時的分子量。
（3）高分子雜質(zhì)測定法
高分子雜質(zhì)系指藥品中分子量大于藥物分子的雜質(zhì)，通常是藥物在生產(chǎn)或貯存過程中產(chǎn)生的高分子聚合物和生產(chǎn)過程中未除盡的可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)的高分子物質(zhì)。
在正文品種規(guī)定的色譜條件下進行分離。
定量方法
①主成分自身對照法同高效液相色譜法項下規(guī)定。一般用于高分子雜質(zhì)含量較低的品種。
②面積歸一化法同高效液相色譜法項下規(guī)定。
③限量法除另有規(guī)定外，規(guī)定不得檢出保留時間小于對照品保留時間的組分，一般用于混合物中高分子物質(zhì)的控制。
④自身對照外標法一般用于SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)的檢查。在該分離系統(tǒng)中，除部分寡聚物外，β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)在色譜過程中均不保留，即所有的高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，以藥物自身為對照品，按外標法計算藥品中高分子雜質(zhì)的相對百分含量。
［附注］SephadexG-10的處理方法。
色譜柱的填裝裝柱前先將約15g葡聚糖凝膠SephadexG-10用水浸泡48小時，使之充分溶脹，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入玻璃柱，一次性裝滿，然后用水將附著玻璃管壁的SephadexG-10洗下，使色譜柱面平整，新填裝的色譜柱要先用水連續(xù)沖洗4～6小時，以排出柱中的氣泡。
樣品的加入進樣可以采用自動進樣閥，也可以直接將樣品加在床的表面（此時，先將床表面的流動相吸干，將樣品溶液沿著色譜管壁轉(zhuǎn)圈緩緩加入，注意勿使填充劑翻起，待之隨著重力的作用滲入固定相后，再沿著色譜管壁轉(zhuǎn)圈緩緩加入3～5mL流動相，以洗下殘留在色譜管壁的樣品溶液）。